EXOCITOSE

O tráfego vesicular em células eucarióticas é essencial para processos celulares diversos, incluindo a manutenção de compartimentos celulares distintos, secreção de proteínas e hormônios, fertilização do óvulo e liberação de neurotransmissores. O ciclo de vida de uma vesícula geralmente consiste de 3 estágios (figura 1): endocitose ou formação da vesícula a partir de membranas celulares específicas; exocitose ou fusão da vesícula com sua membrana alvo; e reciclagem dos componentes da maquinaria protéica após a exocitose. Esta revisão irá focalizar os recentes estudos estruturais das proteínas chaves responsáveis pela exocitose e a reciclagem.

Figura 1: ciclo de vida de uma vesícula sináptica.

A exocitose vesicular é controlada por uma maquinaria protéica que é conservada em organismos percorrendo de leveduras a humanos. Proteínas SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor [NSF]- attachment protein recceptor) são componentes essenciais desta maquinaria. Em exocitose de vesículas sinápticas, três proteínas SNARE estão envolvidas: As proteínas associadas a membrana plasmática sintaxina e SNAP-25 ( proteína de 25 KDa associada a sinaptossoma) e a proteína vesicular sinaptobrevina também referida como VAMP (vesicle-associated membrane protein).

Outras proteínas conservadas incluem o NSF ATPase e sua adaptadora SNAP, a classe Rab de pequenas proteínas G e seus efetores, a família sinaptotagmina e a família nSec1 ( homólogo neuronal da proteína Sec1 de levedura, também referida como Munc 18). Muitos outros fatores que interagem com SNAREs, como as complexinas, VAP33 ( proteína de membrana associada a vesícula/ proteína ligadora de sinaptobrevina) e sinaptofisina têm sido caracterizados.

Figura 2: Estágios e proteínas chaves envolvidas na fusão de membrana de vesícula. As proteínas estão coloridas de acordo com o código: sinaptobrevina (azul escuro), sinaptofisina (azul claro), sintaxina (vermelho), nSec1 (marrom), SNAP-25 (verde escuro), sinaptotagmina (amarelo), Rab3A (círculo vermelho escuro), rabfilina-3A (verde palha), canal de cálcio (magenta), NSF (rosa) e a –SNAP(azul celeste). Pi, fosfato inorgânico.

A figura dois resume alguns dos estágios chaves envolvidos na fusão de vesículas sinápticas. Inicialmente, sintaxina está ligada a nSec1 e sinaptobrevina está provavelmente ligada a um fator tal qual sinaptofisina. Ambas, sintaxina e sinaptobrevina são proteínas com um domínio transmembrana. No estágio de ancoragem, o complexo sintaxina-nSec1 é dissociado talvez assistido por uma proteína efetora Rab. Sinaptobrevina então se liga a sintaxina e SNAP-25. No estágio de preparação (priming), o sistema se torna competente a sofrer fusão desde que haja um aumento na concentração de cálcio, possivelmente envolvendo uma proteína ligadora de cálcio tal como sinaptotagmina. No estágio de reciclagem, a -SNAP (a soluble NSF-attachment protein) e NSF se ligam ao complexo SNARE e o complexo é então dissociado após hidrólise de ATP.

Antes da ancoragem, as vesículas têm que ser direcionadas para a localização correta no tempo apropriado. Este direcionamento não é nem de longe tão bem entendido como os estágios finais de fusão de vesícula. Entretanto, alguns dos componentes moleculares para o processo de direcionamento estão começando a serem caracterizados. Entre eles estão os complexos sec6/8 em células de mamíferos e o complexo exocist em levedura. Estes são complexos macromoleculares grandes (>700KDa) que poderiam estar envolvidos nos processos de direcionamento antes dos SNAREs estarem envolvidos.

SNAREs

O complexo SNARE pode ser isolado a partir de extratos de células neuronais. Ele podem ser também montado a partir de proteínas recombinantemente expressas e purificada in vitro. As âncoras de membrana não são necessárias para a montagem do complexo SNARE, assim a maioria dos estudos biofísicos e estruturais têm sido realizados com os domínios solúveis dos SNAREs. O complexo SNARE exibe notável estabilidade térmica e química. A proteólise limitada do complexo SNARE sináptico tem revelado um complexo central com propriedades biofísicas similares ao complexo integral. Este complexo central é suficiente para promover fusão de vesícula in vitro.

O complexo central SNARE (cerne) consiste de um barril de quatro hélices paralelas enquanto o domínio aminoterminal da sintaxina consiste de um barril de três hélices anti-paralelas (figura 3 e 4). O cerne do barril de quatro hélices do complexo SNARE é composto de camadas formadas pela interação das cadeias laterais de cada uma das 4 a -hélices. Estas camadas são altamente conservadas através da família SNARE inteira. No centro do complexo central (cerne) uma conservada camada iônica tem sido encontrada e consiste de um resíduo de arginina e três de glutamina contribuídos de cada uma das 4 a -hélices. Interessantemente, esta camada iônica está selada contra a água por camadas hidrofóbicas adjacentes. Esta configuração um tanto quanto energeticamente desfavorável presumivelmente tem algum papel funcional durante a associação ou dissociação do complexo SNARE.

Figura 3: Estrutura cristalizada conhecida dos componentes do complexo 20S- complexo SNARE, a –SNAP( ou seu homólogo Sec 17 em levedura) NSF-N, NSF-D2 e a localização especulativa em uma micrografia eletrônica de média rotacional do complexo 20S. O acondicionamento (enovelamento) do domínio NSF-D2 na grade P6 cristalográfica forma um hexâmero que se assemelha co as características de anéis em forma de cone da micrografia eletrônica. Como os domínios D1 e D2 possuem seqüências primárias similares, suas estruturas são também provavelmente similares. Isto sugere que os domínios D1 e D2 compreendem os dois anéis. A localização do domínio-N foi sugerida comparando o empacotamento trimérico dos três domínios NSF-N por unidade assimétrica de uma das formas cristalizadas com a micrografia eletrônica.

Mutações nesta e em outras camadas reduzem a estabilidade do complexo e causam defeitos no tráfego de membrana mesmo em SNAREs distantemente relacionadas. Baseado na conservação do cerne do complexo SNARE, as SNAREs foram reclassificadas em Q-SNARE e R-SNARE e propõe-se que complexos SNARE competentes a sofrerem fusão (priming) geralmente consistem de barris de 4 alfa-hélices compostos na razão de 3 (Q-SNARE): 1(R-SNARE). Uma possível exceção à regra 3Q:1R é o sistema de fusão vacuolar homotípico no qual 5 SNARE distintas interagem. Entretanto, estes experimentos foram realizados com extratos de levedura e analisados por imunoprecipitação, portanto não está claro que todas as 5 SNAREs vacuolares interajam quantitativamente em um complexo pentamérico único.

Figura 4: Sumário das estruturas das proteínas envolvidas na exocitose em vesícula sináptica: complexo SNARE (sinaptobrevina-azul escuro; sintaxina-vermelho; SNAP-25-verde); complexo sintaxina-nSec1 (sintaxina-vermelho; nSec1-marrom); Rab3A-rabfilina-3A (Rab3A-círculo vermelho escuro; rabfilina-3A-verde palha).

As SNAREs têm, no mínimo, três estados conformacionais (figura 5): primeiro, a conformação "fechada" da sintaxina dissociada do complexo e a conformação flexível ou não estruturada de sinaptobrevina e SNAP-25 (figura 5a); segundo, o complexo binário da sintaxina e SNAP-25 (figura5b); e terceiro, o complexo ternário da sintaxina, SNAP-25 e o domínio citoplasmático da sinaptobrevina (figura 5c,d). A conformação fechada da sintaxina dissociada do complexo contém um barril de 4 hélices composto do domínio aminoterminal regulatório HAHBHC e aproximadamente metade do domínio do complexo central Hcore (figura 5a). A topologia desta conformação fechada foi deduzida por dados de ressonância magnética nuclear. Uma conformação similar da sintaxina foi recentemente observada na estrutura cristalizada da sintaxina no complexo sintaxina-nSec1 (figura 4), sugerindo que é a conformação fechada da sintaxina que se liga a nSec1.

Sintaxina muda para um estado "aberto" para se ligar a SNAP-25. Neste estado aberto, a ligação a outras SNAREs é mediado pelo domínio Hcore. Mudanças conformacionais no domínio Hcore, mediada pelo domínio N-terminal da sintaxina, representam um mecanismo regulador para a associação do complexo SNARE por afetar a cinética da formação do complexo ternário. A formação de complexos binários ou ternários está associada com uma indução aumentada da estrutura a -hélice nas regiões não estruturadas ou flexíveis. Como a metade N-terminal do domínio Hcore da sintaxina está sempre enovelada (figura 5), estes dados sugerem que a associação do complexo SNARE começa distal às superfícies da membrana e prossegue através delas. Este modelo "zipper" da fusão de vesícula tem sido proposto por experimentos utilizando transferência de energia ressonante fluorescente, microscopia eletrônica e polarização de spin eletrônico de complexos SNARE marcados.

Figura 5: Estados conformacionais e eventos envolvendo as proteínas SNAREs e seus possíveis papéis na fusão de vesícula. As SNAREs possuem no mínimo três estados conformacionais: (a) fechado; (b) binário; (c,d) ternário. Sinaptobrevina-azul; sintaxina-vermelho; SNAP-25-verde. Indeterminado, nenhuma informação disponível sobre a conformação ou conformações da proteína; Flexível, resíduos que estão provavelmente passando por significante mudança em solução e não são parte de um domínio rígido da proteína. C, região carboxi-terminal; N, região amino-terminal.

O PAPEL DAS SNAREs

Enquanto a função exata dos SNAREs é o tópico de alguns debates, existem várias evidências que eles desempenham um papel fundamental na fusão de membrana. Primeiro, a clivagem sítio específica das SNAREs por neurotoxinas clostridiais inibem a neurotransmissão. Segundo, os SNAREs representam a maquinaria de fusão mínima: SNAREs reconstituídos em lipossomos artificiais podem induzir fusão in vitro. Experimentos em um sistema de células PC12 permeabilizadas também confirmaram a importância dos SNAREs para a fusão in vivo. Terceiro, os domínios solúveis dos SNAREs espontaneamente reúnem-se em um barril de 4 hélices extremamente estável in vitro. A composição a -helical e a alta estabilidade térmica e química do complexo é similar para as proteínas que estão envolvidas na fusão viral, possivelmente indicando um mecanismo ancestral comum para ambos os sistemas de fusão. Quarto, a formação do complexo provavelmente prossegue de uma maneira direcional, iniciando no na extremidade do complexo distal à membrana e prosseguindo para a extremidade proximal à membrana.(figura 5). Este processo de associação direcional pode trazer proximidade às membranas, assim superando a barreira de energia livre para a stalk formation (figura 6).

Figura 6: Estágios da fusão de membrana baseados em estudos biofísicos de fusão de endossomas e um modelo hipotético de como os complexos SNAREs unem as membranas. A formação do estado stalk requer energia livre. As barreiras de energia livre existem entre os estados stalk, o estado de hemifusão e o estado fundido do sistema. A formação do complexo SNARE poderia reduzir o nível de energia livre do estado stalk e poderia reduzir ou aumentar os níveis das barreiras de energia livre em combinação fatores acessórios tais como sinaptotagmina em um modelo dependente de cálcio. A composição lipídica específica das vesículas sinápticas e a membrana plasmática poderia também desempenhar um papel na modulação destas barreiras de energia livre. G, energia livre requerida para justaposicionar as membranas; G‡, barreiras da energia livre que devem ser superadas para completar a fusão da vesícula com a membrana.

O modelo hipotético apresentado na figura 6 assume a existência de um estado parcialmente associado dos SNAREs ancorados entre duas membranas. Embora este estado não seja observado diretamente, há uma evidência indireta para um estado intermediário. Primeiro, os sítios de clivagem de todas as proteases neurotóxicas clostridiais estão localizadas na metade C-terminal (membrana proximal) do complexo central (cerne). Como as SNAREs são protegidas contra proteólise no complexo inteiramente associado, isso sugere que os SNAREs devem existir em estados parcialmente associados ou estados "frouxos" por períodos de tempos significativos. Experimentos recentes apoiam esta hipótese: O C-terminal da sinaptobrevina é sensível a toxinas no estado ancorado, mas o N-terminal não é sensível. Estudos cinéticos de exocitose em células cromoafins revelaram um estado fusão-competente que é sensível ao ataque de neurotoxinas clostridiais. A inibição da montagem do complexo SNARE por ligação de anticorpos afeta diferencialmente os componentes cinéticos da exocitose, sugerindo a existência de estados do complexo SNARE frouxo e compacto.

Análises de fusão de lipossomas artificiais induzida por polietileno glicol (PEG) têm sugerido a existência de 2 estágios intermediários da fusão de vesícula: um estado stalk e um estado de hemifusão (Figura 6). Assumindo que estados similares existam durante a fusão de vesículas celulares com as membranas alvo, pode-se especular que a formação do complexo SNARE poderia diminuir a

barreira de energia livre a fim de alcançar o estado intermediário stalk. Adicionalmente, a formação do complexo SNARE poderia diminuir as barreiras do estado de transição de energia livre entre os estado stalk, o estado de hemifusão e o estado fundido do complexo SNARE. Entretanto é provável que outros fatores (tais como proteínas ou composição lipídica das vesículas sinápticas) estejam envolvidos na regulação destas barreiras de energia livre, especialmente em vista do fato de que a fusão de vesícula neuronal é estreitamente regulada por cálcio e prossegue em uma escala de tempo mais rápida (milissegundos) que pode ser acompanhada por fusão induzida por SNAREs in vitro (minutos).

Estudos in vitro da fusão vacuolar homotípia durante a divisão celular de levedura mostraram que os complexos SNARE podem ser dissociados antes da fusão. Estas observações não necessariamente excluem o papel dos SNAREs para a fusão de membranas. É possível que os complexos SNAREs possam ser dissociados, sem que haja a "desancoragem" das membranas. Caso o sistema já esteja comprometido para a fusão em um estágio irreversível de hemifusão.

As interações SNARE são promíscuas

A conservação da seqüência primária do core estrutural do complexo SNARE lança dúvidas sobre o papel de direcionamento dos SNAREs para o tráfego de vesículas, como foi originalmente proposto pela hipótese SNARE. De fato, muitas das propriedade biofísicas e bioquímicas têm sido obtidas in vitro para complexos consistindo de combinação artificiais de SNAREs que são localizados para diferentes compartimentos celulares in vivo. Além disso, alguns SNAREs podem funcionar em diversos passos de transporte diferentes in vivo. Assim, os SNAREs não podem ser os únicos determinantes para a especificidade de direcionamento das vesículas. Ao invés disso, as localizações observadas de SNARE podem ser importantes para as interações com outros fatores tais como nSec1 que interage com resíduos não conservados de SNARE.

Interações de sintaxina com nSec1.

O estado parcialmente estruturado "fechado" da sintaxina interage com nSec1 (fig.4). A conformação da sintaxina encontrada na estrutura cristalográfica deste complexo é dramaticamente diferente da conformação da sintaxina encontrada no complexo SNARE ternário. Os resíduos carboxi-terminal da sintaxina que não são estruturados ou são flexíveis em solução adotam uma sequência de pequenos fragmentos a -hélice conectados por curtas loops quando está ligada a nSec1 formando um complexo. No complexo SNARE ternário esses resíduos formam uma a -hélice contínua.

As regiões flexíveis da sintaxina antes de formar o complexo SNARE poderiam ter estrutura local semelhante à estrutura da sintaxina no complexo nSec1-sintaxina (fig.4). É provável que nSec1 atue estabilizando uma das conformações da sintaxina antes de formar o complexo SNARE. A transição conformacional da sintaxina é um exemplo surpreendente do papel da flexibilidade conformacional na função biológica.

Experimentos em leveduras sugerem uma interação entre Sec1 e o complexo SNARE associado a membrana plasmática. Isto é um contraste com os achados em neurônios, em que interações entre sintaxina e nSec1 e entre sintaxina, SNAP-25 e sinaptotabrevina, são mutuamente exclusivas. Se as conclusões tiradas dos experimentos em leveduras e neurônios são corretas poder-se-ia especular que o homólogo de nSec1 em leveduras tem uma estrutura diferente, que duas conformações distintas existem para a família de proteínas Sec1, ou que uma interação transiente existe entre nSec1 e o complexo SNARE parcialmente associado.

SINAPTOTAGMINA

É uma proteína associada a membrana que interage com SNAREs, fosfolipideos de membrana, canais de Ca2+ e proteínas envolvidas na endocitose. Na porção citosólica dessa proteína um ligante (linker) de sete aminoácidos flexíveis une dois domínios homólogos C2, C2A e C2B (fig.4). O domínio C2A se liga a fosfolípideos aniônicos e a outras proteínas acessórias, tal como a sintaxina, de maneira dependente de Ca2+. Nenhuma mudança conformacional é observada após a ligação do Ca2+, exceto para mudanças rotaméricas de resíduos de ácido aspártico coordenados por Ca2+. O domínio C2B promove a ligação de outros domínios C2B, bem como a ligação de proteínas acessórias independentemente de Ca2+. Interessantemente, proteínas neuronais como a rabfilina e Doc2 também possuem múltiplos domínios C2 similares aos da sinptotagmina. A estrutura do domínio C2B da rabfilina é muito similar para o domínio C2B de sinaptotagmina III.

Sinaptotagmina e o complexo SNARE interagem independentemente de Ca2+, embora a interação seja acentuada pela adição de Ca2+. Os domínios de ligação ao Ca2+ provavelmente interagem com a membrana plasmática, enquanto as regiões poli-básicas poderiam interagir com o cerne do complexo SNARE.

Rab 3

Membros da família Rab de pequenas proteínas G regulam o tráfego vesicular de membranas em todas as células eucarióticas. Rab3A localiza-se predominantemente em vesículas sinápticas e desempenha um importante papel na regulação da liberação de neurotransmissores. Proteínas Rab eram suspeitas de serem determinantes da especificidade do direcionamento vesicular, pois isoformas distintas exibem localizações celulares únicas. Entretanto, estudos de proteínas Rab quiméricas sugerem que Rabs podem funcionar em dois passos de transporte distintos – o transporte vesicular do RE para Golgi e a fusão de vesículas secretórias pós-Golgi com a membrana plasmática – sugerindo que Rabs não podem ser os únicos determinantes do direcionamento. Como outras pequenas proteínas G, os membros da família Rab podem funcionar como chaves (switches) moleculares ou cronômetros, variando entre a forma inativa, ligada a GDP, e a forma ativa ligada a GTP e regulando suas proteínas efetoras e seus alvos downstream.

No citosol, proteínas Rab são mantidas no estado inativo, ligado a GDP pela Rab GDI (inibidor da dissociação de GDP), impedindo-as de se ligar inespecificamente às membranas. Quando Rab se liga a um compartimento doador específico ou vesícula, GDI é deslocado pelo fator de deslocamento de GDI (GDF). A troca de GDP por GTP é então catalisada pelas GEFs (fator de troca de guanina), ativando a proteína Rab e tornando-a resistente a remoção da membrana pela Rab GDI. GTP é hidrolizado pela atividade intrínseca da proteína Rab. A barreira do estado de transição da reação de hidrólise é diminuída pelas proteínas ativadoras de GTPase (GAPs). Uma vez que a fusão da vesícula tenha ocorrido, GDI pode liberar a forma ligada a GDP de Rab para o citoplasma e o ciclo começa novamente.

O knockout do gene Rab3A dificulta a regulação da liberação do neurotransmissor. A forma ligada ao GTP de Rab3A interage com, no mínimo, duas proteínas efetoras, rabfilina 3A e rim, que podem interagir com, , alvos downstream ainda desconhecidos. Rab3A ativada reversivelmente recruta rabfilina-3A para vesículas sinápticas. Rim tem similaridade de seqüência a rabfilina-3A, mas localiza-se na zona ativa da membrana pré-sináptica ao invés de nas vesículas sinápticas.

Um número relativamente grande de proteínas Rab e seus efetores estão presentes em células eucariótas. Uma base estrutural para o pareamento específico entre essas proteínas tem sido recentemente proposta baseada na estrutura de Rab3A-GTP-Mg2+ ligada ao domínio efetor de rabfilina-3A (fig.4). Rabfilina-3A contacta Rab3A primariamente em duas áreas distintas; poucas mudanças conformacionais são observadas após a formação do complexo. Baseado na estrutura cristalizada do complexo Rab3A-rabfilina-3A, foi proposto que pequenas proteínas G geralmente podem ter diversas áreas de superfície para o reconhecimento do efetor.

NSF

De acordo com um modelo atual, NSF e SNAP atuam juntas para dissociar os complexos SNARE ante e após a fusão. Proteínas SNARE podem formar ambos complexos cis (mesma membrana) e trans (membranas opostas) que são substratos para SNAPs e NSF. Como discutido acima, os complexos SNARE trans são importantes para a fusão de membranas. Fusão de membranas opostas resulta na formação de complexos SNARE cis que são dissociados para reciclagem e reativação pela ação conjunta de SNAP e NSF.

NSF é um hexâmero e pertence a família de proteínas AAA (ATPases associadas com as atividades celulares). Cada NSF contém três domínios: um domínio amino-terminal requerido para ligação SNAP-SNARE e dois domínios ATPase, chamados D1 e D2. A ligação de ATP e hidrólise por D1 é necessária para a que ocorra a reação de dissociação de SNARE e a ligação de ATP, mas não a hidrólise, por D2 é necessária para a formação do hexâmero. SNAP e NSF ligam-se sequenciamente a complexos SNARE, formando os assim chamados particulas 20S, assim chamado devido ao comportamento de sedimentação do super complexo. (fig.3).

a -SNAP

Interações entre a -SNAP (Sec17), o homólogo de levedura de a -SNAP e SNAREs têm sido parcialmente mapeadas usando mutações e estudos de ligação in vitro. A região da SNAP que interage como complexo SNARE sobrepõe com suas regiões formadoras de complexo central. Isso, em conjunto com a estrutura do complexo central sináptico e a promiscuidade observada das interações SNAP-SNARE, sugerem que SNAPs reconhecem características gerais da superfície do barril de quatro hélices paralelas (forma ou distribuição de carga eletrostática). De fato, a curvatura dos sulcos do barril de quatro hélices do complexo SNARE é similar à curvatura da folha torcida de Sec17 (fig3). A microscopia eletrônica e estudos de mutagênese de complexos SNAP-SNARE sugerem que SNAP reveste o complexo SNARE ao longo da maior parte do seu comprimento.

CONCLUSÕES

Progressos significativos têm sido obtidos na elucidação das estruturas de proteínas envolvidas na exocitose vesicular. Uma das mais intrigantes propriedades da maquinaria de fusão vesicular é a natureza altamente dinâmica de interações proteína-proteína: parceiros de ligação freqüentemente mudam e proteínas sofrem mudanças conformacionais dramáticas (fig.4). Estruturas cristalizadas podem apenas fornecer relances da maquinaria da proteína. Ainda permanece um desafio conectar esses fatos a fim de se obter um "filme" da maquinaria de fusão vesicular e dos próprios processos de fusão.